全面认识LNP递送mRNA用于治疗癌症
由于COVID-19 mRNA疫苗（Comirnaty和Spikevax）的成功，mRNA在各种疾病的预防和治疗中受到了极大的关注。为了满足治疗目的，要求mRNA必须进入目标细胞并表达足够的蛋白质，因此，开发有效的配送系统是必要和关键的。以脂质纳米颗粒（LNP）为代表一些的载体加快了mRNA的应用，其中不乏一些基于mRNA的治疗方法被批准或正在进行临床试验。本文重点讨论mRNA-LNP介导的抗癌疗法，总结了mRNA-LNP制剂的主要开发策略，讨论了癌症的代表性治疗方法，并指出这一研究领域当前挑战和未来可能方向。
基于mRNA的应用有几个优点，包括快速设计和瞬时表达，以及易于扩大生产规模。因此，mRNA显示出作为疫苗的巨大潜力，例如，在癌症治疗方面。mRNA可以很容易地通过合理的序列设计来产生任何种类的蛋白质，这大大促进了治疗癌症的替代策略的发展。其中包括表达肿瘤相关抗原和肿瘤免疫疗法的治疗抗体、通过编码肿瘤抑制蛋白直接进行肿瘤杀伤、调节肿瘤微环境或肿瘤细胞以提高治疗效果。此外，最近报道的通过传递CAR mRNA的嵌合抗原受体（CAR）细胞生产可能为实现这一目标提供另一种有吸引力的方法。
由于mRNA的物理化学特性，较大的分子量、负电荷和易降解性，裸露的mRNA不能有效地进入细胞，这使得它难以达到治疗目的。一个理想的递送系统需要有效地封装mRNA，使其不被降解，能够有选择地针对特定的细胞类型，促进内体逃逸，并最终将其释放到细胞质中进行蛋白质表达。到目前为止，各种生物衍生和化学性质的材料已经被开发出来，如外泌体，细菌外膜囊泡（OMVs），和病毒样颗粒（VLPs，如假分型的PEG10 VLPs），在某些应用中具有吸引力。在基于化学的递送系统中，基于聚合物和脂质的纳米颗粒由于高效性和多样性而被广泛使用。聚合物包括聚（胺基共酯）（PACE），聚（乙二醇）（PEG-PGBA），聚（β-氨基酯）（PBAEs）等，电荷改变可影响基于脂质聚合物迁移率。脂质纳米粒子（LNP）被认为是递送mRNA第一选择，COVID-19 mRNA疫苗（Comirnaty和Spiikevax）的成功证明了这一点。目前，在临床试验中，有十多种mRNA药物使用LNP作为其输送工具。这些案例涵盖了传染病和癌症的疫苗，以及遗传性疾病的治疗方法。值得注意的是，最近发布的数据显示，呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗（Moderna公司的mRNA-1345）的3期试验在60岁以上的成年人中达到了其主要疗效终点，对RSV下呼吸道疾病（RSV-LRTD）的疫苗疗效为83.7%。在另一个案例中，个性化的mRNA癌症疫苗（来自Moderna和Merck的mRNA-4157/V940）在完全切除后对高风险黑色素瘤患者的辅助治疗中也显示出积极的效果，与单独的pembrolizumab相比，联合治疗使复发或死亡的风险降低了44%。最近FDA批准了上述两种信使核糖核酸LNP疫苗的突破性治疗指定（BTD），表明该领域具有广阔的前景。为了更好地理解mRNA-LNP技术及其应用，在此首先回顾了LNP输送系统的发展，然后通过mRNA-LNP平台总结了癌症治疗的策略。
LNP发展
通常情况下，LNP由四种成分组成：可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质（图1）。每个组分对LNP的稳定性、转染效力和安全性方面起着关键作用。mRNA-LNP制备，通常将脂质和mRNA分别溶解在乙醇和酸性水相中（例如，pH4.0柠檬酸缓冲液）。之后，乙醇和水相以1:3的体积比与微流控装置混合，从而自组装形成LNP。在此期间，可电离阳离子脂质将被质子化为带正电，然后通过静电相互作用与带负电的mRNA结合，从而将mRNA封装在LNP内。同时，其他辅助脂质，包括磷脂、胆固醇和木质化脂质，在它们上面自我组装，以稳定形成的mRNA-LNP。随后，mRNA-LNP溶液通过缓冲交换调整为中性pH值，在此期间，可电离的脂质变得不带电，使它们在生理pH值下稳定且毒性较低。
图1
尽管多成分使LNP的变得复杂，但赋予了其多样性。到目前为止，各种LNPs已经形成并得到验证，主导了mRNA治疗的临床应用。LNP开发的主要策略，包括：1）设计和筛选新型脂质分子；2）调整LNP的内部脂质比例；3）LNP的表面修饰。
可电离的阳离子脂质
可电离阳离子脂质是LNP表述中的关键成分，其酸解离常数（pKa）决定了LNP的电离和表面电荷，进一步影响了其稳定性和毒性。以前用于核酸递送的传统永久带电阳离子脂质（如DOTAP）很容易与带负电的血清蛋白相互作用并在血液中聚集，这会导致单核吞噬细胞迅速清除LNP，使其血液中的半衰期很短。此外，阳离子脂质相对较高的溶血活性增加了毒副作用的风险，如红细胞膜损伤导致的血红蛋白释放。为了规避这些问题，人们开发了pKa值通常为6.0-7.0的可电离阳离子脂质。这种基于可电离脂质LNP（iLNP）确保在酸性条件下有效包埋核酸，并降低在生理条件下循环过程中的毒性。进入内体/溶酶体（pH低于表面pKa），LNP可以再次带正电，以促进内体逃逸，将mRNA释放到细胞质中。研究发现，LNP的pKa值为6.2-6.5和6.6-6.9，分别有利于siRNA在体内的肝脏递送和mRNA疫苗的肌肉内给药。
可电离阳离子脂质可以分为三个部分：氨基头部、疏水尾部和连接子，每个部分的化学多样性导致了许多结构上不同的可电离脂质，这些脂质可以由组合化学产生。根据氨基头部的数量，可电离阳离子脂质可以被归类为单氨基或多氨基脂质。DLin-MC3-DMA（MC3）、SM-102和ALC-0315是最著名的单氨基酸脂质。它们也是FDA批准的三种用于RNA输送的可电离阳离子脂质。研究人员通常专注于调整脂质尾部结构，通过改变尾部数量、设计线性或分支结构以及引入不饱和或可生物降解的键来赋予增强的效力或特定功能，例如，MC3中的不饱和尾巴和L319中的酯键在促进siRNA的内体逃逸和加速脂质的细胞内降解中发挥重要作用。通过提供更大的头部基团，多氨基可电离阳离子脂质比单氨基可离子化的阳离子脂质具有更大的可变性，已经设计研究了许多众脂质，如306O i10、cKK-E12、C12-200、5A2-SC8、TT3、FTT5。
图2
体外和体内的高通量筛选（HTS）通常用于筛选可电离脂质（图2）。上面提到的大多数都是通过这种方法获得的。以肝脏为目标的LNPs更容易获得，因为LNPs在静脉注射时主要在肝脏积累。此外，研究表明，血液中的大量载脂蛋白E（ApoE）可以被吸附到传统的LNPs表面，从而通过ApoE-LDLR（低密度脂蛋白受体）的相互作用促进其肝细胞进入。5A2-SC8 LNP是由HTS获得的针对肝脏的代表之一（图2A），Zhou等人在超过1500个可模块化降解的候选脂质中，找出了5A2-SC8 LNP，发现5A2-SC8 LNP可以在体内高效递送let-7g抑癌基因miRNA，从而显著抑制肿瘤生长，延长癌症模型的生存期。HTS还提供了发现递送肝脏以外RNA的LNPs可能性。Dahlman等人，设计的聚合物脂（如7C1），可以有效地将RNA输送到多个器官的内皮细胞，包括肺部和骨髓（图2B）。Miller等人开发了一种具有肺部靶向性的两性氨基脂质ZA3-Ep10。Fenton等人开发的OF-Deg-Lin LNP，能有效地在脾脏中表达蛋白质（>85%），并在体内实现有效的B淋巴细胞靶向（~7%），显示出调节B细胞功能的潜力（图2C）。最近，设计并筛选了几种新的可电离脂质，用于开发mRNA疫苗，如AA3DLin、OC2-K3-E10、4N4T（MIC1和MIC2）、IC8和YK009。
图3
除了HTS之外，探索可电离阳离子脂质和联合靶向分子的结构-活性关系（SAR）可能为指导LNPs的设计提供一种合理的方式。Qiu等人报道说，肝脏和肺部靶向输送可以通过特定的脂质结构实现。他们通过开发N个系列的LNPs实现了肺部靶向的mRNA输送，这些LNPs在脂质类物质的丙烯酰胺尾部含有酰胺键（图3A）。Zhao等人发现含有咪唑基团的类脂化合物可以将mRNA传递到T淋巴细胞，铅结构93-O17S在CD4+和CD8+小鼠脾脏T淋巴细胞中分别实现了8.2%和6.5%的基因重组。大脑是给药系统的一个难点具有挑战性，受神经递质（如色胺衍生物）血脑屏障（BBB）通透性的启发，Ma等人开发了基于神经递质衍生的脂质（NT脂质）的LNP，成功地将小分子药物、核酸和蛋白质通过血脑屏障输送到神经元细胞中，实现了有效的脑输送（图3C）。这项工作扩展了LNP的可及器官，并可能为治疗难治性中枢神经系统疾病提供帮助。利用类似的概念，Upen Mitchell团队Xue等人设计了双磷酸盐（BP）功能化的可电离脂质，并配制了增强mRNA向骨微环境递送的BP LNP（图3D）。考虑到肿瘤细胞中的高活性氧物种（ROS）水平，Cai等人通过加入硫酮体分子来促进肿瘤细胞选择性的mRNA输送，开发了ROS可降解的电离脂质。Miao等人设计和合成的脂质体具有异环胺头部，可以通过干扰素基因的刺激器（STING）途径激活免疫细胞，这大大增强了mRNA-LNP癌症疫苗的抗肿瘤效力（图3E）。这些例子表明，对SAR的深入研究可能会加速功能性可电离脂质的发展。
磷脂
磷脂是辅助脂质，有助于脂质纳米颗粒的形成和内体的逃逸。在临床前研究和临床应用中，常用的磷脂是DSPC和DOPE，已经使用了多年，为了克服传统磷脂结构不灵活和难以获得的反应的局限性，Liu等人开发了数百种称为iPhos的可电离磷脂。他们发现，性能最好的9A1P9含有一个两性离子头部和三个烷基尾部，其功效分别是DSPC和DOPE的40倍和965倍。iPhos脂质的独特结构使它们在内体中更容易形成锥体形状，随后促进了内体膜的融合，最后增强了膜的不稳定性和货物释放（图4A）。此外，基于iPhos的LNP可以实现向肝脏、脾脏和肺部的靶向递送，为器官特异性递送信使核糖核酸和CRISPR-Cas9基因编辑系统提供了巨大的前景。通过体外磷脂结构的系统筛选，Benedicto等人证明磷酸乙醇胺（PE）头部基团对增强LNPs的膜融合和内体逃逸具有重要意义。此外，他们发现磷脂可以改变器官向性，两性离子型主要实现肝脏靶向递送，而阴离子型则促进脾脏靶向递送。
胆固醇
胆固醇有助于提高LNP的稳定性和膜融合，优化胆固醇的结构也可以增强LNPs的递送功效，赋予LNPs特殊的功能。Paunovska等人发现，含有酯化胆固醇的LNP可以提高递送效率。基于DNA条形码的体内筛选显示，胆固醇油酸酯结合的LNPs可以优先靶向肝内皮细胞。利用Cre mRNA和DNA条形码系统筛选胆固醇衍生物，他们进一步确定侧链氧化的胆固醇影响肝脏中LNP的细胞类型递送。研究发现，20α-羟基胆固醇（20α-OH）LNPs向内皮细胞和Kupffer细胞递送mRNA的能力是肝细胞的5倍（图4B）。这些结果证明，胆固醇的化学结构可能是LNPs靶向递送mRNA的另一个重要因素，胆固醇也可以提高递送效率。Patel等人筛选了各种天然胆固醇类似物，发现β-谷甾醇LNP（eLNP）的转染效率显著提高，他们分析了胆固醇类似物的SAR，并注意到eLNP具有多面体形态和不同的表面脂质组成，这可能导致内体逃逸和mRNA释放增强。最近，Patel等人通过在LNP中取代给定百分比的氢胆固醇（12.5%、25%、50%和100%的取代百分比）来筛选一系列胆固醇类似物，他们的研究结果表明，50%7α-羟基胆固醇的替代使体外T细胞的mRNA递送提高了2倍。
聚乙二醇化脂质
聚乙二醇化脂质的掺入以减少纳米颗粒的聚集，延长循环时间，并逃避单核吞噬细胞的吞噬作用。然而，PEG化也带来了“PEG困境”，阻碍了与靶细胞的相互作用和随后的内体逃逸，导致转染效率降低。在之前的研究中，Mui等人。测量的三种PEG基化脂质在具有14、16或18个碳的二烷基链的siRNA-LNPs中的解吸率。他们发现，聚乙二醇化脂质中的碳链越短，解吸速度越快。他们进一步发现，1.5 mol%的PEG 2000-lipids是形成稳定的LNPs而不损失RNA传递效率的最佳选择。这些数据表明，二烷基链的长度和PEG基化脂质的浓度对LNPs体内的药代动力学、药效学和生物分布有很大影响。除了长度之外，PEG段的分子量也可能影响LNPs的传递效力。PEG 2000似乎足以维持其功能，并被广泛用于传递RNA。简而言之，需要对上述参数进行微调，可以获得一个平衡的结构，使PEG基化脂质的有利影响最大化。
图4
优化LNP组分
选择组分和比率对于LNP介导的mRNA输送至关重要。Miao等人描述了通过引入混合可电离脂质（cKK-E12:A6 = 7:3，摩尔比）来优化LNPs的策略。他们发现，优化的LNPs可以提高mRNA的传递效率，并通过重复给药提高耐受性。他们进一步发现，优化的LNP依赖基于白蛋白的肝脏定位，而不是普遍认可的ApoE途径。这项研究表明，更具协同性的LNPs值得关注。
除了肝脏靶向，优化LNPs的组分可以使mRNA输送到非肝脏组织。Cheng等人报道了一种选择性ORgan靶向（SORT）方法，该方法增加了第五种成分以实现组织特定的mRNA输送。在已建立的5A2-SC8 LNPs中加入50%的永久阳离子脂质（如DOTAP）、30%的阴离子脂质（如18PA）或20%的可电离脂质（如1,2-二烯-3二甲基氨基丙烷，DODPA），分别实现了小鼠肺、脾脏和肝脏的mRNA表达（图5A）。SORT技术为组织定位提供了一个通用的策略，可以在不同的LNP系统中重现。他们不仅将SORT技术应用于MC3和C12-200 LNPs，而且还利用iPhos脂质开发了新一代的SORT LNPs（iPhos LNPs）。Cui等人。在SARS CoV-2的治疗中，通过提供CasRx系统敲除肺部的导管蛋白L（Ctsl），再现了肺部SORT LNPs。关于SORT LNPs的目标定位机制，Dilliard等人提出了一个关于SORT LNPs的目标定位机制。发现在注射后至少需要三个过程，包括PEG基化的脂质解吸，结合特定的血清蛋白，以及与目标细胞上相应受体的相互作用。他们进一步分析了每个SORT LNP的蛋白质冠状图，发现血清ApoE、体外蛋白（Vtn）和β2-糖蛋白I（β2-GPI）可能分别对肝脏、肺部和脾脏的目标有主要贡献（图5B）。理解这些机制是至关重要的，它可以指导新的目标LNPs设计，并减少相对随机筛选过程的工作量。
图5
最近有几个使用类似策略的目标LNPs被报道。首先，Luozhong 等人通过在四组LNPs中加入5%的DOPS，实现了二级淋巴器官（SLO）的递送。他们证明，SLO靶向可能是由于从磷酸二酯（PS）到吞噬细胞的“吃我”信号，增强了吞噬细胞与LNP的相互作用。另一项研究也支持这种机制，在LNPs中用合成的乙醇可溶性PS衍生物取代PC。其次，LoPresti等人用各种带电脂质取代了常用的DOPE，形成了四组分LNP。含有DOTAP和DOPS的LNP分别将mRNA递送到肺和脾脏。同样，Pattipeuluhu等人发现，通过在Onpattro制剂中用阴离子DSPG取代DSPC，mRNA可以优先输送到肝脏网状内皮系统，而不是传统的肝细胞。Cao等人开发了基于多溴联苯醚的五元素纳米颗粒（FNPs），其由优化的多溴联苯胺、DOPE、胆固醇、DMG-PEG和DOTAP组成，可以有效地将mRNA输送到肺部，机制研究表明，肺靶向依赖于FNPs表面的玻璃体凝集素结合，这与之前报道的SORT机制一致。
除了LNP的脂质组成外，N/P（N指可电离阳离子脂质的胺基，P指mRNA的磷酸基团）摩尔比也对LNP的性质有很大影响。通常，N/P比为3:1至6:1用于封装较大的核酸有效载荷，随着N/P比率的降低，每个LNP可以获得更高的mRNA有效载荷，而mRNA的包封效率可能会降低。通常，较高的N/P比可以提供更高的包封率，但在体内给药时可能会引起更高的毒性。最近的一项发现称，具有低N/P比率的LNP在内体pH范围内表现出更高的质子化水平，并且在体外和体内更有效。因此需要对该比率进行微调以达到更好的递送效率。
LNP的表面修饰
表面修饰为LNP递送功能提供了一种有效的途径。特别是将抗体或其他分子偶联到LNP上可以提高其靶向能力（图6）。
抗体修饰
肺部靶向治疗对于相关疾病如癌症、囊性纤维化（CF）和原发性纤毛运动障碍（PCD）至关重要。但是肺选择性递送仍然具有挑战性，肺细胞上的特异性受体可提高递送系统的靶向亲和力。Parhiz等人基于马来酰亚胺硫醇反应，通过将PECAM-1抗体与LNP偶联来制备肺靶向LNP。LNPs在肺部输送mRNA的效率比它们的同类产品高200倍以上。类似地，Li等人通过基于Diels-Alder反应将质膜囊泡相关蛋白1（PV1，在小突触中表达）抗体与LNP偶联，开发出小突触化LNP，与常用的马来酰亚胺硫醇法相比，这种化学反应可以在血液循环中产生更稳定的偶联物。抗体修饰的LNP mRNA在肺部的蛋白质表达比非靶向对照LNP高约40倍。在通过抗体修饰免疫细胞中，T细胞是一个热点，到目前为止，CD3、CD4、和CD5抗体修饰的LNP被报道并验证了在体内向T淋巴细胞传递mRNA（图6）。有了这个平台，原位细胞治疗得以实现，并为疾病治疗提供一项突破性技术。此外，Veiga等人。通过ASSET（Anchored Secondary scFv Enabling Targeting）平台设计了一个反Ly6c单克隆抗体（mAb）修饰的LNP，它可以将IL-10 mRNA送入Ly6c+白细胞。制造的LNPs在炎症性肠病（IBD）小鼠模型中表现出明显的疗效。最近，Shi等人报道了一种c-kit（CD117）抗体修饰的LNP，可以有效地将RNA输送到体内的造血干和祖细胞（HSPCs）。转染的HSPCs保留了它们的干性，并产生了高水平的编辑子代，表明抗体靶向LNP在HSPC基因治疗中的高度可行性。总的来说，这些突出的结果证明了抗体修饰策略在靶向mRNA-LNP递送方面的巨大潜力。
图6 LNP表面修饰
基于mRNA的癌症治疗
癌症免疫疗法
基于mRNA的癌症免疫治疗具有巨大的潜力，因为mRNA可以设计成表达任何蛋白以诱导所需的免疫反应。一种常见的策略是递送肿瘤抗原编码的mRNA用于免疫，或者可以利用mRNA产生细胞因子、免疫检查点抑制剂或其他功能蛋白，以重塑肿瘤微环境（TME）并恢复免疫适应性。此外，mRNA与传统治疗方法的结合也是癌症治疗的一个有吸引力的策略。
图7
癌症疫苗
由于mRNA快速有效、低成本和表达任何蛋白质的灵活性，mRNA疫苗受到了极大的关注。mRNA疫苗在对抗传染病方面取得了巨大成功，目前通过表达肿瘤相关抗原（TAAs）在癌症治疗中发挥着重要作用，mRNA应该首先被输送到抗原呈递细胞（APC）中，在那里产生TAA或新抗原，APC表面的组织相容性复合物（MHCs）与T淋巴细胞结合，可激活CD4+和CD8+T淋巴细胞并最终杀死肿瘤细胞（图7A）。这些疫苗可以通过静脉注射、肿瘤内注射、皮内注射或肌肉注射的方式给药。许多病例已在临床试验中进行了测试，少数病例已进入第2阶段。
Oberli等人优化了编码卵清蛋白（OVA）、酪氨酸酶相关蛋白2（TRP2）或糖蛋白100（gp100）的27位突变版本的mRNA-LNP，以治疗B16F10肿瘤的小鼠模型。所获得的mRNA LNP制剂引发了有效的抗原特异性CD8+T细胞免疫应答，并显著抑制了肿瘤生长。他们发现，添加脂多糖（LPS，一种Toll样受体4激动剂）可以进一步增强小鼠的抗肿瘤功效，延长小鼠的生存期。Islam等人通过共递送OVA mRNA和佐剂C16-R848（一种TLR7/8激动剂）开发了另一种类型的纳米疫苗。他们制造了一种聚合物-脂质混合纳米颗粒平台，该平台可以同时刺激先天免疫和适应性免疫，以诱导强大的OVA特异性CD8+T细胞反应。当治疗携带OVA表达的淋巴瘤和前列腺癌症的小鼠时，纳米疫苗对肿瘤生长的预防率为84%，抑制率为60%（图7B）。最近，Chen等人报道了一种113-O12B的淋巴结靶向LNP，它可以有效地将OVA mRNA或TRP-2肽（TRP2 180-188）递送到APC。这种纳米疫苗在B16F10黑色素瘤小鼠模型中表现出显著的生长抑制作用（图7C）。值得注意的是，BioNTech开发的RNA脂复合物（RNA-LPX）的平台可以通过静脉给药有效地将mRNA递送到DC中，RNA-LPX传递四种抗原（MAGE-A3、NY-ESO-1、酪氨酸酶和TPTE），诱导干扰素-α（IFNα）释放，并在一些黑色素瘤患者中产生强烈的T细胞抗肿瘤反应，显示出作为有效的癌症免疫治疗剂的巨大潜力。
治疗性抗体
过去的几十年里，抗体介导的癌症治疗广泛应用。通过序列设计，mRNA也有可能编码治疗性抗体。据报道，由mRNA产生的抗体表现出较长的半衰期，而且成本低于基于蛋白质的抗体。到目前为止，mRNA已经设计表达各种抗体，如单克隆抗体（mAbs）、双特异性T细胞参与抗体（bsAbs）及其衍生物。Rituximab是一种CD20靶向单克隆抗体，为治疗非霍奇金淋巴瘤而开发。Thran等人利用mRNA-LNPs产生rituximab，并在体外和体内验证其抗肿瘤效果。他们证明，在Raji模型中，即使在较低的剂量下（50 μg vs.200 μg，静脉注射）下，mRNA-LNPs也比重组利西单抗显示出更好的肿瘤抑制作用。同样地，Rybakova等人开发了抗HER2抗体（trastuzumab）mRNA-LNPs，显示了对HER2阳性肿瘤生长的有效抑制（图9A）。程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）通路因其通过传递抑制信号抑制免疫系统的作用而受到极大关注。在此基础上，开发出的几种阻断此途径的抗体已被批准用于治疗癌症。利用这一概念，产生了mRNA编码的PD-1/PD-L1抗体。Wu等人利用LNPs递送编码Pembrolizumab（一种抗PD-1单克隆抗体）的mRNA，从而内源性产生治疗性抗体（图9A），与直接注射Pembrolizumab蛋白相比，mRNA-LNPs明显改善了抗体的药代动力学参数和人PD-1敲入MC38肿瘤小鼠模型的肿瘤抑制作用。bsAbs的应用由于其复杂的生产过程、较差的稳定性和血清中的短半衰期，仍然存在挑战。通过bsAb编码的mRNA体内生成bsAbs可能是一种有利的方法。Stadler等人。设计和合成了mRNA编码Hist-tagged bsAbs（RiboMABs）（图9A）。体内数据显示，RiboMABs可以诱导特定的T细胞显著渗透到肿瘤部位，导致强大的抗肿瘤效果和肿瘤根除。最近，Huang等人开发了一种新型的mRNA-LNP系统，编码B7H3× CD3 bsAbs，显示出治疗血液学恶性肿瘤和黑色素瘤的疗效，这种方法可以加速bsAbs的临床发展。
免疫调节因子
细胞因子是一类分泌蛋白，可以调节不同的细胞类型和细胞活动，尤其是在免疫系统中。它们可以作为促炎剂（例如IL-12、TNFα、IFN-γ）或抗炎剂（例如IL-4、IL-10、IL-13）。一些药物通过抑制肿瘤的发展和进展而被广泛用于癌症治疗。白细胞介素-12（IL-12）可以激活T淋巴细胞并诱导显著的IFN-γ分泌，从而杀死肿瘤细胞并招募免疫细胞用于癌症治疗。Lai等人通过使用肝脏靶向的IL-12 mRNA LNPs鉴定了IL12的抗肿瘤作用。在肝细胞癌（HCC）小鼠模型中，LNPs可以诱导CD44+CD3+CD4+T辅助细胞显著浸润到肿瘤中，并增加IFNγ的产生，从而产生显著的肿瘤抑制作用（图9B）。尽管细胞因子在癌症治疗中备受关注，但由于其毒性，包括3级和4级不良反应，其全身给药受到阻碍。因此，局部注射（例如i.t.）更容易接受。此外，编码细胞因子的mRNA可以与其他免疫调节因子结合，产生协同治疗效果。例如，Hewitt等人在肿瘤内注射IL-23、IL-36γ和OX40L三重态mRNA LNPs用于肿瘤免疫治疗。结果表明，IL23和IL-36γ的联合作用可以调节TME并增强其抗肿瘤作用。此外，T细胞共刺激物OX40L的加入可以进一步改善免疫反应。该治疗平台显著诱导T细胞浸润、肿瘤抑制和针对肿瘤再激发的持久免疫记忆。值得注意的是，当治疗免疫环境较差的肿瘤时，这种三重mRNA疗法改善了免疫检查点抑制剂（ICIs）的效果（图9C）。Haabeth等人也报道了用于肿瘤治疗的mRNA混合物。局部注射OX40L、CD80和CD86 mRNA混合物，并在A20和CT26模型中观察到有效的肿瘤抑制作用。最近，Yan等人开发了R848（一种TLR7/8激动剂）衍生的LNPs，可以将CD40 mRNA递送到DC中。通过Anti-CD40抗体的组合，该平台显著增强了抗肿瘤反应并产生了记忆免疫效应（图9D）。这项工作通过整合先天免疫和适应性免疫为癌症治疗提供了一种选择。
图9
采用细胞疗法
迄今为止，已有六种CAR-T细胞产品获得FDA的批准,另外还有许多临床实验正在开展，证明了过继细胞治疗的前景光明。与将CAR DNA插入宿主细胞的方法相比，mRNA-LNP递送的CAR短暂表达且没有插入突变的风险，使得mRNA变得更具吸引力。
1. 体外生产
电穿孔通常用于难以转染的细胞（如T细胞），并已被用于递送mRNA产生离体CAR-T细胞。使用这种方法，Kenderian等人和Beatty等人产生CD33特异性CAR-T细胞和基于mRNA的间皮素CAR-T细胞，分别用于治疗急性髓细胞白血病（AML）和实体恶性肿瘤。两者都显示出强大的抗肿瘤功效，并显著降低了靶向和非靶向毒性。Xiao等人也通过mRNA电穿孔构建了NKG2D CAR-NK细胞。然而，电穿孔可能导致严重的细胞毒性，在体内难以利用。因此，LNP可以尝试克服这些限制。例如，Billingsley等人。合成了24种可电离的脂质，并在筛选后获得了最佳效率的C14-4。他们通过实验设计（DOEs）进一步优化了C14-4 LNPs的配方，并实现了基于mRNA的CD19 CAR-T细胞的有效生产。与电穿孔或病毒转染相比，LNP生成的CAR-T细胞表现出相同的杀死癌细胞的能力（图10A）。同样地，Ye等人使用mRNA-LNP平台成功生成了CAR巨噬细胞（CAR-Ms）和体外CAR-T细胞，两者都显示出对B淋巴瘤的显著毒性作用（图10B）。由于其易于处理和相当或更高的功效，LNPs为生成基于mRNA的CAR细胞提供了一种更方便的方法。
2. 体内生产
与传统的离体工程化细胞相比，利用mRNA技术在体内生产CAR-T细胞更具吸引力，因为它具有成本效益和时效性。Parayath等人设计了一种基于聚合物的载体，用于在体内产生CAR-T和TCR-T细胞。阳离子PBAE聚合物首先与CAR mRNA复合，然后通过静电相互作用将抗CD8-PGA吸收到复合物表面，用于T细胞靶向。注射纳米颗粒后，成功产生CD19特异性1928z CAR-T细胞和HBcore18-27 TCR-T细胞，受体表达可平均持续7天。此外，与体外病毒转导的T细胞相比，基聚合物递送mRNA的CAR-T或TCR-T细胞在淋巴瘤、前列腺癌和乙型肝炎病毒（HBV）诱导的肝细胞癌中表现出同等的抗肿瘤效果。最近，Rurik等人也采用了这种策略来治疗心脏纤维化。他们开发了CD5靶向成纤维细胞活化蛋白（FAP）CAR mRNA-LNP，以在体内产生CAR-T细胞（图10C）。体内产生的CAR细胞在癌症治疗中也显示出巨大潜力。
图10
溶瘤病毒
据报道，溶瘤病毒（OVs）可选择性杀伤肿瘤细胞并调节肿瘤微环境以治疗癌症。然而，重复给药可能会引发抗病毒免疫反应，从而降低治疗效果。Kennedy等人通过将病毒基因组RNA（vRNA）封装到LNP中，开发了一种合成RNA溶瘤病毒平台。使用这种策略，塞内加谷病毒（SVV）和柯萨奇病毒A21在肿瘤细胞中选择性复制，在测试的肿瘤模型中导致显著的免疫激活。值得注意的是，合成SVV在存在中和抗体的情况下仍然有效，这表明RNA-LNP平台在克服重复给药挑战方面具有巨大潜力。
总体来说，mRNA治疗癌症是一种极具潜力的革命性癌症治疗方式，若能通过各种新型方法，提高mRNA的体内递送效率表达对于改善癌症患者的生存率和提高其生活质量具有重要意义，我们期待未来能够有更多的研究结果和临床应用数据，进一步推动mRNA疗法的发展和推广。
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